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光遗传系统的试验操作方法分享

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  光遗传系统利用分子生物学、病毒生物学等手段,将外源光敏感蛋白基因导入活细胞中,在细胞膜结构上表达了光敏感通道蛋白;然后通过特定波长光的照射,控制细胞膜结构上的光敏感通道蛋白的激活与关闭;光敏感蛋白的激活和关闭可控制细胞膜上离子通道的打开与关闭,进而改变细胞膜电压的变化,如膜的去极化与超极化。
 
  光遗传系统技术通过一定波长的光对细胞进行选择性地兴奋或者抑制,达到控制特定类型细胞活动的目的。光遗传学技术对细胞的选择性目前主要通过三种方法实现:
 
  通过病毒载体直接选择性表达光感基因。相比转基因动物,病毒载体具有很多优势,包括:制备周期短,从载体克隆到病毒表达只需要数周时间就可以完成;可用于难以转基因的动物,如灵长类等;病毒表达只局限于注射位点,如某个特定的脑区,因此具有空间选择性;某些病毒具有天然嗜性,只感染一些特定的细胞类型等。目前广泛用于光遗传学研究的病毒载体是慢病毒和腺相关病毒载体。
 
  病毒注射常见问题解析:
 
  病毒保存:病毒-80分装储存,避免反复冻融,4度保存建议不超过一周。使用过程中病毒置于冰上或放在4度冰箱,尽量减少在室温的放置时间。
 
  病毒稀释:无菌PBS或生理盐水稀释均可,稀释后尽量一次用完。
 
  病毒注射针尖堵住的处理方法:首先使用生理盐水棉球擦拭针尖,注射泵快推后针尖仍堵住则要剪掉部分电极。
 
  确定注射到脑组织:观察玻璃电极内病毒与液体石蜡接触液面分层是否下降。
 
  病毒较多漏到目标脑区上方核团的原因:注射完停针时间不够,原则上不少于10min;注射速度较快,建议注射速度选择10-30nl/min,注射时间控制在10min为宜。
 
  根据目标核团、病毒滴度、病毒种类和功能元件大小确定注射量。
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